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BCA蛋白濃度檢測原理、操作及常見問題
更新時間:2025-05-15 點擊量:142

BCA蛋白濃度檢測原理、操作及常見問題


 

一、實驗原理

 

BCA與二價銅離子的硫酸銅等其他試劑混合一起即為BCA工作試劑。在堿性條件下, BCA工作液與蛋白質結合時,蛋白質將二價銅離子還原為一價銅離子, 一個一價銅離子螯合兩個BCA分子,工作試劑變色,在562nM處有高的光吸收值,并與蛋白質濃度成正比,據(jù)此繪制標準曲線,檢測蛋白的OD值,即可得到濃度值。

二、應用范圍

1. BCA法測定蛋白濃度可以兼容樣品中高達5%SDS,5%Triton X-100,5%Tween2060、80。但本試劑盒受螯合劑和略高濃度的還原劑的影響,需確保EDTA低于10mM,無EGTA,二硫蘇糖醇(DTT)低于1mM,β-巰基乙醇(β-Mercaptoethanol)低于0.01%。(tips:認真看說明書, 不僅是BCA檢測試劑盒說明書, 還有蛋白裂解液說明書, 清楚裂解液的試劑配方, 如果不適用BCA法,可以考慮其他方法測定蛋白濃度)

2. 靈敏度高, 檢測濃度下限達到25μg/ml,最小檢測蛋白量達到0.5μg,待測樣品體積為1-20μl。

3. 50-2000μg/ml濃度范圍內有較好的線性關系,因此樣品濃度過高需適當稀釋。

三、實驗準備

1. BCA蛋白濃度測定試劑盒

2. PBS緩沖液

3. 96孔板

4. 酶標儀

5. 37℃恒溫培養(yǎng)箱

四、試劑配置

1. 蛋白標準品: 5mg/ml BSA

完全溶解蛋白標準品,取5mg/ml BSA蛋白標準品10μl,加入90μlPBS稀釋為0.5mg/ml BSATips:稀釋后的0.5mg/ml BSA蛋白標準可以一次全配好,分裝后-20℃長期保存)。

2. BCA工作液配制

根據(jù)樣品數(shù)量和重復次數(shù), 200μl每孔計算所需工作液的體積。 BCA工作液按50體積BCA試劑A1體積BCA試劑B(50:1)配制適量,充分混勻(Tips:由于加樣誤差適當多配一些,配好的BCA工作液室溫在24小時內穩(wěn)定,因此可以在提蛋白前配好)。

五、實驗操作

1. 蛋白標準品濃度梯度配制

2. 加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中。如果樣品不足20μl,需加PBS補足到20μl。(Tips:記錄加入待檢測樣品的體積)

3. 各孔加入200μl BCA工作液, 96孔板震蕩30sec,37℃恒溫培養(yǎng)箱放置30分鐘。(Tips:也可以室溫放置2 小時。 BCA法測定蛋白濃度時,顏色會隨著時間的延長不斷加深。并且顯色反應會因溫度升高而加快。如果濃度較低,適合在較高溫度孵育,或適當延長孵育時間)

4. 用酶標儀測定562nM的吸光度(Tips:也可以使用分光光度計測定)。

5. 以蛋白含量(μg)為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪出標準曲線,根據(jù)標準曲線和使用的樣品體積計算出樣品的蛋白濃度。

六、常見問題

1. 測定標準曲線時發(fā)現(xiàn)隨著標準品濃度的增加吸光度或顏色沒有明顯變化??赡艿脑蚴菢悠分泻袊乐馗蓴_BCA法測定蛋白濃度的物質。

2. 建議每次測定時都做標準曲線。因為BCA法測定時顏色會隨著時間的延長不斷加深,并且顯色反應的速度和溫度有關,所以除非精確控制顯色反應的時間和溫度,否則如需精確測定宜每次都做標準曲線。

3. 一般提取的蛋白濃度應該在多少μg/μl?組織在1-30μg/μl,細胞低一些大概0.1-10μg/μl。

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