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聚合酶鏈式反應(yīng)ELISA法

聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）是分子生物學技術(shù)中檢測DNAzui靈敏的方法之一，而酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）是免疫學中zui敏感和特異的檢測方法的代表。聚合酶鏈式反應(yīng)ELISA法（PCR-ELISA）集上述兩方法之精髓，成為繼PCR之后又一個靈敏性更高、特異性更強、省時易行的新方法[7]。根據(jù)生物素和地谷新標記底物的不同，PCR-ELISA主要分為兩大類：*類為用生物素和地谷新同時對PCR產(chǎn)物進行標記；第二類則是分別對PCR擴增產(chǎn)物和核酸雜交探針進行標記。

生物素和地谷新同時標記PCR產(chǎn)物主要有三種途徑：①在PCR反應(yīng)混合物中同時加入生物素和地谷新標記的脫氧核苷酸類似物（DIG-Bio-dUTP）;②加入生物素化的引物和DIG-dUTP;③加入生物素化引物1和地谷新標記的引物2。實驗方法如下：將標記的PCR產(chǎn)物用乙醇沉淀，或用純化柱除去未結(jié)合的標記物，加至親合素包被的酶標板孔中孵育1~2h，*洗滌，加抗地谷新抗體，然后加入堿性磷酸酶結(jié)合物底物孵育，終止反應(yīng)后，根據(jù)吸光度（A）值判斷結(jié)果。這類親合素介導的固相捕獲生物素標記的靶分子檢測系統(tǒng)，靈敏度高于PCR檢測，且操作簡便、快速，重復應(yīng)用性好，可以在短時間內(nèi)（<4h）準確檢測大量的臨床標本（血清、分泌液或甲醛固定標本）；通過適當調(diào)整PCR循環(huán)次數(shù)及相關(guān)參數(shù)并對多時間點上產(chǎn)量進行線性分析，可對PCR產(chǎn)物進行定量分析。由于檢測系統(tǒng)是建立在雙標記核酸片段上的，有時會出現(xiàn)非特異性PCR產(chǎn)物吸附，引起本底偏高的現(xiàn)象。

第二類PCR-ELISA為生物素和地谷新分別標記PCR擴增產(chǎn)物和核苷酸探針。用生物素化的引物進行PCR擴增，然后加入親和素包被的酶標板中，冰浴1h，經(jīng)洗滌后加入變性劑（50mmol/L NaOH）室溫作用數(shù)分鐘，加入雜交液和地谷新標記的探針，雜交完成經(jīng)洗滌后加入堿性磷酸酶標記的抗地谷新抗體，室溫下作用1h經(jīng)充分洗滌后加顯色劑，讀取A值。該方法利用生物素化引物獲得含生物素的PCR產(chǎn)物，使產(chǎn)物能與包被在酶標板上的親和素牢固地結(jié)合，使特異性PCR擴增產(chǎn)物吸附于酶標板上，繼而用地谷新標記的探針進行雜交和放大，這一方法特異性強，靈敏度高，重復性好。

PCR-ELISA方法的*性主要表現(xiàn)在以下四個方面。①利用生物素-親和素系統(tǒng)的強大親和能力，其親和常數(shù)K約為抗原抗體的104~107倍，為A蛋白（SPA）對IgF。的108倍。生物素和親和素二者高度特異的快速結(jié)合，不易受外界干擾，復合物十分穩(wěn)定，極少發(fā)生離解，提高了實驗的穩(wěn)定性，縮短了反應(yīng)時間。此外，親和素不含糖基，等電點為pH=6.0，與其他抗原或抗體包被酶標板比較，其非特異性吸附顯著減少，靈敏度得到提高。②PCR擴增使陽性信號通過擴增本身以及地谷新抗原抗體反應(yīng)得到極大程度的放大，從而使檢測的靈敏度進一步提高。③PCR-ELISA中尿嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)移酶的使用，使PCR技術(shù)中交叉污染得以極大程度的控制而不影響檢測效果，基本克服了PCR雜交技術(shù)中由于污染造成的假陽性問題。④標記探針的使用，使檢測的特異性進一步提高，可以與放射性標記的Southern雜交相媲美，且探針的引進使其應(yīng)用的范圍增大，比PCR本身在基因多態(tài)性分析、病毒分型、克隆鑒定等方面顯示了其*的優(yōu)勢。另外，非同位素標記系統(tǒng)的應(yīng)用又避免了使用同位素帶來的危害，而且整個實驗周期較Southern雜交明顯縮短（約 6h），并且操作簡便，可用于大批量標本的同時檢測。當然PCR-ELISA方法的建立有一定的要求，其中PCR產(chǎn)物和探針的雜交條件（PCR產(chǎn)物的稀釋度、雜交溫度和時間）與檢測敏感性、特異性有密切關(guān)系。